Antiserum

Gemeinsame FACS-Färbeprotokolle
Hinweis : Diese Informationen dienen als Leitfaden, da einzelne Prüfer möglicherweise Protokolle für ihren jeweiligen Zelltyp optimieren müssen.

Direkte Immunfärbung von Oberflächenantigenen

Indirekte Immunfärbung von Oberflächenantigenen

Allgemeines Immunfärbeverfahren für intrazelluläre Antigene

Intrazelluläre Cytokin / Phospho-Immunfärbung

In-Vitro-Zellstimulations-Referenztabelle

Färbung des Farbstoffausflusses

DNA-Gehalt oder Zellzyklusanalyse
Jede menschliche Zelle exprimiert Hunderttausende von Zelloberflächenantigenen, die ihren Zelltyp, ihre biologische Funktion, ihr Entwicklungsstadium und vieles mehr angeben. Zellen, die in verschiedenen Organen leben, weisen charakteristische Zelloberflächenantigene auf, und die Bestimmung dieser Zellen unter Verwendung der spezifischen Fluorochrom-konjugierten Antikörper kann durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Die Färbung mit nicht konjugiertem gereinigtem Antikörper erfordert einen zusätzlichen Schritt der Färbung mit einem fluoreszierenden konjugierten sekundären Antikörper (indirekte Immunfärbung).

Hinweis : Wenn die Zellen in einer U- oder V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gefärbt werden, sollte zuerst das Waschverfahren eingerichtet werden, um ungebundene Primärantikörper maximal zu entfernen.

Direkte Immunfärbung von Oberflächenantigenen
Schlüsselreagenzien – PBS, Färbepuffer, FACS-Puffer, PFA-Fixierungspuffer

Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension unter Verwendung des entsprechenden Protokolls vor und stellen Sie die Zellkonzentration in Färbepuffer auf 10 7 Zellen / ml ein
Geben Sie 100 µl Zellsuspension in so viele Färberöhrchen wie nötig [nicht gefärbte Kontrolle, Kompensationskontrollen, optionale Isotyp- und FMO-Kontrollen und Testprobe].
Die optimierte Verdünnung der Antikörper in die jeweiligen Röhrchen geben und 30 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C (auf Eis) inkubieren.
Waschen Sie die Zellen einmal mit eiskaltem PBS bei 300-400 xg und resuspendieren Sie sie in 100-200 µl FACS-Puffer / PFA-Fixierungspuffer.
Bei 4 ° C im Dunkeln lagern und vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden erwerben.
Indirekte Immunfärbung von Oberflächenantigenen
Schlüsselreagenzien – PBS, Färbepuffer, FACS-Puffer, PFA-Fixierungspuffer

Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension unter Verwendung des entsprechenden Protokolls vor und stellen Sie die Zellkonzentration in Färbepuffer auf 10 7 Zellen / ml ein.
Geben Sie 100 µl Zellsuspension in so viele Färberöhrchen wie nötig [nicht gefärbte Kontrolle, Kompensationskontrollen, optionale Isotyp- und FMO-Kontrollen und Testprobe].
Die optimierte Verdünnung der Primärantikörper in die jeweiligen Röhrchen geben und 30 Minuten bei 4 ° C (auf Eis) inkubieren.
Wasche die Zellen einmal mit eiskaltem PBS bei 300-400 xg und resuspendiere in 100 ul Färbepuffer.
Fügen Sie die spezifischen Sekundärantikörper in der richtigen Verdünnung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 4 ° C (auf Eis) im Dunkeln.
Waschen Sie die Zellen einmal mit kaltem PBS bei 300-400 xg und resuspendieren Sie sie in 100-200 µl FACS-Puffer / PFA-Fixierungspuffer.
Bei 4 ° C im Dunkeln lagern und vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden erwerben.
Allgemeines Immunfärbeverfahren für intrazelluläre Antigene
A. Permeabilisierung mit Methanol
Schlüsselreagenzien – PBS, Färbepuffer, FACS-Puffer, 0,5-4% PFA in PBS [genaue Konzentration von PFA muss für jedes Antikörperpanel standardisiert werden], 100% Methanol

Führen Sie eine Oberflächenfärbung gemäß Protokoll 1 oder 2 zusammen mit den geeigneten Kontrollen durch.
Die gefärbten Zellen in 0,5-4% PFA mit 10 7 Zellen / ml aliquotieren. Bereiten Sie nicht gefärbte Aliquots für die intrazellulären Färbekontrollen vor.
Befestigen Sie die Zellen 10 bis 30 Minuten vor Lichteinfall auf Eis.
Das Fixiermittel bei 300-400 xg auswaschen und langsam eiskaltes 100% iges Methanol unter leichtem Vortexen zugeben.
Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten vor Lichteinfall auf Eis.
Wasche das Methanol bei 400-500 xg aus und suspendiere die Zellen in 100 ul Färbepuffer.
Geben Sie 100 µl Zellsuspension in so viele Färberöhrchen wie nötig [nicht gefärbte Kontrolle, Kompensationskontrollen, optionale Isotyp- und FMO-Kontrollen und Testprobe].
Die optimierte Verdünnung der Primärantikörper in die jeweiligen Röhrchen geben und 30 Minuten bei 4 ° C (auf Eis) inkubieren.
Wasche die Zellen einmal mit eiskaltem PBS bei 400-500 xg und resuspendiere in 100 ul Färbepuffer.
Fügen Sie die spezifischen Sekundärantikörper in der richtigen Verdünnung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 4 ° C (auf Eis) im Dunkeln.
Waschen Sie die Zellen einmal mit kaltem PBS bei 400-500 xg und resuspendieren Sie sie in 100-200 µl FACS-Puffer / PFA-Fixierungspuffer.
Bei 4 ° C im Dunkeln lagern und vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden erwerben.
B. Permeabilisierung mit Saponin
Schlüsselreagenzien – PBS, Färbepuffer, FACS-Puffer, 0,5-4% PFA in PBS [genaue Konzentration von PFA muss für jedes Antikörperpanel standardisiert werden], 0,1% Saponin

Führen Sie eine Oberflächenfärbung gemäß Protokoll 1 oder 2 zusammen mit den geeigneten Kontrollen durch.
Die gefärbten Zellen in 0,5-4% PFA mit 10 7 Zellen / ml aliquotieren. Bereiten Sie nicht gefärbte Aliquots für die intrazellulären Färbekontrollen vor.
Befestigen Sie die Zellen 10 bis 30 Minuten vor Lichteinfall auf Eis.
Das Fixiermittel bei 300-400 xg auswaschen und 0,1% Saponin hinzufügen.
Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Saponin bei 300-400 xg auswaschen und die Zellen in 100 ul Färbepuffer resuspendieren.
Geben Sie 100 µl Zellsuspension in so viele Färberöhrchen wie nötig [nicht gefärbte Kontrolle, Kompensationskontrollen, optionale Isotyp- und FMO-Kontrollen und Testprobe].
Die optimierte Verdünnung der Primärantikörper in die jeweiligen Röhrchen geben und 30 Minuten bei 4 ° C (auf Eis) inkubieren.
Wasche die Zellen einmal mit eiskaltem PBS bei 400-500 xg und resuspendiere in 100 ul Färbepuffer.
Fügen Sie die spezifischen Sekundärantikörper in der richtigen Verdünnung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 4 ° C (auf Eis) im Dunkeln.
Waschen Sie die Zellen einmal mit kaltem PBS bei 400-500 xg und resuspendieren Sie sie in 100-200 µl FACS-Puffer / PFA-Fixierungspuffer.
Bei 4 ° C im Dunkeln lagern und vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden erwerben.
Intrazelluläre Cytokin / Phospho-Immunfärbung
Das intrazelluläre Färbeverfahren ermöglicht die direkte Messung von Antigenen (Zytokinen oder Transkriptionsfaktoren), die im Zytoplasma oder im Zellkern vorhanden sind, zusätzlich zur gleichzeitigen Bestimmung des Oberflächenantigens. Bei diesem Verfahren ist die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen nach Färbung mit fluoreszierenden konjugierten Oberflächenantigenen erforderlich. Dieses modifizierte Färbeverfahren ermöglicht die direkte Messung der funktionellen Aktivität jeder interessierenden Zelle in Blut oder anderen Geweben ohne weitere Trennung. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, kann eine zusätzliche In-vitro-Zellstimulation mit einigen gängigen Mitogenen (z. B. PMA, Ca ++ oder Peptidepitopen und Proteintransportinhibitor, Brefeldin A usw.) erforderlich sein, was eine erhöhte Produktion von Zytokinen in Zellen ermöglicht.

Schlüsselreagenzien – PBS, Färbepuffer, FACS-Puffer, 0,5% PFA in PBS, 0,1% Saponin oder 100% Methanol, geeignetes Zellstimulans, Brefeldin A oder Monensin

Hinweis : Wenn die Zellen in einer U- oder V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gefärbt werden, sollte zuerst das Waschverfahren eingerichtet werden, um ungebundene primäre oder sekundäre Antikörper maximal zu entfernen.

Ernten Sie die Zellen unter Verwendung des geeigneten Protokolls und aliquotieren Sie sie in Röhrchen mit der vorgegebenen Konzentration (abhängig vom Zelltyp und Stimulans).
Fügen Sie das spezifische Stimulans hinzu und inkubieren Sie die Zellen für die erforderliche Zeit bei 37 ° C. Die folgende Tabelle ist eine praktische Referenz der verschiedenen Stimulanzien und der Inkubationszeit gegenüber den Zielproteinen.
Bei Färbung auf sekretierte Zytokine während der Inkubationszeit Brefeldin A oder Monensin in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration zugeben.
Legen Sie einige nicht stimulierte Aliquots für die nicht gefärbte Kontrolle und die gefärbten Grundlinienkontrollen beiseite.
Stoppen Sie die Stimulation, indem Sie die Zellen mit der Endkonzentration von 0,5% PFA fixieren.
Vorsichtig vortexen und die Zellen 15 Minuten auf Eis halten.
Das Fixiermittel abwaschen und mit der Oberflächenfärbung gemäß Protokoll 1 oder 2 fortfahren.
Die Zellen in dem bevorzugten Permeabilisierungsreagenz resuspendieren und die Permeabilisierung und intrazelluläre Färbung entsprechend gemäß Protokoll 3a oder 3b (100% Methanol oder 0,1% Saponin) fortsetzen.