Probleme aus den Western-Blot-Tests

Der folgende Leitfaden dient als Checkliste für die möglichen Ursachen und Lösungen in Bezug auf einige der am häufigsten auftretenden Probleme aus den Western-Blot-Tests.

  1. Hoher Hintergrund

    S.No. Mögliche Ursache Lösung
    1 Zu hohe Antikörperkonzentration
    • Optimieren und verringern Sie die Antikörperkonzentration
    2 Aggregierte sekundäre Antikörperbildung
    • Filtriere den sekundären Antikörper durch ein 0,2 um Filter
    • Verwenden Sie einen neuen sekundären Antikörper
    3 Zu hohe Antikörperinkubationstemperatur
    • Inkubieren Sie den Antikörper bei 4 ° C.
    4 Unspezifische sekundäre Antikörperbindung oder Kreuzreaktivität mit Blockierungsmittel
    • Führen Sie eine sekundäre Antikörperkontrolle durch (ohne die primäre).
    • Verringern Sie die sekundäre Antikörperkonzentration
    5 Kreuzreaktivität des primären oder sekundären Antikörpers mit dem Blockierungsmittel
    • Tween-20 zum Inkubations- und Waschpuffer geben
    6 Inkompatibles Blockierungsmittel
    • Vergleichen Sie verschiedene Blockierungspuffer
    7 Unvollständige Blockierung
    • Optimieren Sie die Auswahl des Blockierungspuffers
    • Erhöhen Sie die Proteinkonzentration im Blockierungsmittel
    • Blockierzeit und / oder Temperatur optimieren; 2 Stunden bei normaler Temperatur oder über Nacht bei 4 ° C blockieren
    • Fügen Sie 0,05% Tween 20-Waschmittel zum Blockierungsmittel hinzu
    • 0,05% Tween 20-Detergens in die Antikörperverdünnungslösung geben
    8 Unzureichende Blockierung
    • Verlängern Sie die Blockierungszeit oder verwenden Sie ein kompatibles Blockierungsmittel (z. B. Magermilch, BSA, Serum usw.).
    9 Kreuzreaktivität des Antikörpers mit anderen Proteinen
    • Verwenden Sie ein anderes Blockierungsmittel (Verwenden Sie keine Magermilch mit Biotinsystem
    • Reduzieren Sie die sekundäre Antikörperkonzentration
    • Testen Sie die Kreuzreaktivität zwischen sekundärem Antikörper und Membran
    10 Unzureichende Wäsche
    • Erhöhen Sie die Anzahl der Waschvorgänge und das Puffervolumen
    • 0,05% Tween 20-Waschmittel in den Waschpuffer geben
    11 Zu lange Belichtungszeit
    • Belichtungszeit reduzieren
    12 Membranproblem
    • Verwenden Sie eine saubere Pinzette. Mit Handschuhen bedienen
    • Verwenden Sie neue Membranen
    • Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit ausreicht, um die Membran feucht zu halten
    • Verwenden Sie bei der Inkubation die Entfärbungstabelle
    • Überlappende Membranen vermeiden
    • Vorsichtig behandeln und Membranschäden vermeiden
    13 Unzureichende Membranwäsche
    • Erhöhen Sie die Anzahl der Waschvorgänge
    14 Inkompatible Membran
    • Der Hintergrund der Nitrocellulosemembran ist niedriger als der der PVDF-Membran
    fünfzehn Trockene Membran
    • Stellen Sie sicher, dass die Membran mit einer ausreichenden Menge Flüssigkeit bedeckt ist, und verhindern Sie, dass sie austrocknet
    16 Kontaminierter Puffer
    • Verwenden Sie vor der Verwendung einen neuen Puffer oder Filterpuffer
    17 Kontaminierte Ausrüstung
    • Stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Werkzeuge sauber sind und kein Gel auf der Membran verbleibt
  2. Schwaches / kein Signal

  3. species
    western blot
    S.No. Mögliche Ursache Lösung
    1 Unsachgemäßer Proteintransfer zur Membran
    • Färben Sie das Gel nach Abschluss der Übertragung, um festzustellen, ob die Übertragung effizient ist
    • Verwenden Sie Ponceau S, um die Membran zu färben und festzustellen, ob die Übertragung effizient ist
    • Stellen Sie während des Transfers einen ausreichenden Kontakt zwischen Gel und Membran sicher
    • Stellen Sie sicher, dass das Transfer-Sandwich richtig montiert ist
    • Nasse Membran gemäß Anleitung
    • Überhitzung während der Elektroübertragung vermeiden
    • Verwenden Sie Positivkontroll- oder Molekulargewichtsmarker
    • Übertragungszeit und Strom optimieren
    • Verwenden Sie den membranübertragenden Puffer von Boster (AR1149).
    • Vermeiden Sie bei der Handhabung die Zerstörung der Probe (Antigendeterminante)
    2 Unzureichende Protein- und Membranbindung
    • Zugabe von 20% Methanol zum Transferpuffer
    • Verwenden Sie eine Membran mit kleiner Bohrung
    3 Unzureichender Antikörper
    • Erhöhen Sie die Antikörperkonzentration
    4 Unzureichendes Antigen
    • Laden Sie mehr Protein
    5 Antigenmaskierung durch Blockieren des Puffers
    • Vergleichen Sie verschiedene Blockierungspuffer
    • Optimieren Sie die Proteinkonzentration des Blockierungsmittels
    • Blockierzeit reduzieren
    6 Vorhandensein von Natriumazid in Puffern
    • Natriumazid aus den Puffern entfernen
    7 Zu kurze Belichtungszeit
    • Verlängern Sie die Belichtungszeit des Films
    8 Zu kurze Inkubationszeit des Substrats
    • Die Inkubationszeit des Substrats auf fünf Minuten verlängern
    9 Verdauung von Protein auf der Membran
    • Menge des Blockierungsmittels optimieren
    10 Proteinabbau während der Lagerung
    • Proteinprobe erneut vorbereiten
    11 Inkompatible primäre und sekundäre Antikörper
    • Stellen Sie sicher, dass Primärantikörper, Sekundärantikörper, Substrat, Enzymsystem und Proben kompatibel sind
    • Verwenden Sie die Ladekontrolle, um die Wirksamkeit des zweiten Erkennungssystems zu testen
    12 Niedrige Konzentration an Primärantikörper und / oder Sekundärantikörper
    • Erhöhen Sie die Antikörperkonzentration
    • Inkubationszeit erhöhen
    13 Kreuzreaktivität zwischen Blockierungsmittel und Antikörpern (primär oder sekundär)
    • Verwenden Sie ein mildes Reinigungsmittel wie Tween20
    • Change Blocker (häufig verwendet werden Milch, BSA, Serum oder Gelatine)
    14 Unfähigkeit des primären Antikörpers, das Protein in der getesteten Probe zu erkennen
    • Überprüfen Sie die Anweisungen
    • Positivkontrolle verwenden
    fünfzehn Niedriger oder kein Gehalt an Zielprotein (unwirksames Antigen)
    • Positivkontrolle verwenden
    • Erhöhen Sie die Beladungsmenge auf 20-30 µg Protein pro Vertiefung
    • Verwenden Sie einen Proteaseinhibitor oder ein Zielprotein mit fraktioniertem Extrakt
    16 Unzureichende Übertragung und übermäßiges Waschen
    • Überprüfen Sie die Übertragung mit Ponceau S.
    • PVDF-Membran in Methanol einweichen
    • Vermeiden Sie übermäßiges Waschen
    17 Überblockierung
    • Verwenden Sie 0,05% Magermilch oder keinen Milchverdünnungspuffer
    • Blockierungsmittel wechseln
    • Blockierzeit reduzieren
    18 Verlust der Wirksamkeit des Primärantikörpers
    • Bereiten Sie frischen Antikörper vor und lagern Sie ihn ordnungsgemäß, wenn Sie ihn nicht verwenden
    • Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen
    19 Hemmung des sekundären Antikörpers durch Natriumazid
    • Vermeiden Sie die Verwendung von Natriumazid zusammen mit HRP-konjugierten Antikörpern
    20 Verlust der Wirksamkeit in Enzymkonjugat und Substrat
    • Enzymkonjugat und Substrat mischen (keine Farbentwicklung, wenn das Enzym inaktiv ist)
    • Verwenden Sie aktiviertes Enzymkonjugat und frisches Substrat
    21 Unsachgemäße Nassübertragung für die Membran
    • PVDF-Membran in 100% Methanol einweichen
    22 Unzureichendes Molekulargewicht des Zielproteins (<10 kDa)
    • Verwenden Sie eine Membran mit kleiner Bohrung
    • Übertragungszeit reduzieren
    23 Gleichheit oder Nähe der Werte zwischen dem isoelektrischen Punkt des Zielproteins und dem pH-Wert des Transferpuffers
    • Probieren Sie andere Puffer wie CAPS-Puffer (pH 10,5) aus.
    • Versuchen Sie Puffer mit niedrigem pH-Wert wie Essigsäurepuffer
    24 Zu hohe Methanolkonzentration
    • Verringern Sie die Methanolkonzentration oder verwenden Sie Isopropylalkohol