Probleme aus den Western-Blot-Tests

Der folgende Leitfaden dient als Checkliste für die möglichen Ursachen und Lösungen in Bezug auf einige der am häufigsten auftretenden Probleme aus den Western-Blot-Tests.

1. Hoher Hintergrund

   S.No.	Mögliche Ursache	Lösung
   1	Zu hohe Antikörperkonzentration	Optimieren und verringern Sie die Antikörperkonzentration
   2	Aggregierte sekundäre Antikörperbildung	Filtriere den sekundären Antikörper durch ein 0,2 um Filter Verwenden Sie einen neuen sekundären Antikörper
   3	Zu hohe Antikörperinkubationstemperatur	Inkubieren Sie den Antikörper bei 4 ° C.
   4	Unspezifische sekundäre Antikörperbindung oder Kreuzreaktivität mit Blockierungsmittel	Führen Sie eine sekundäre Antikörperkontrolle durch (ohne die primäre). Verringern Sie die sekundäre Antikörperkonzentration
   5	Kreuzreaktivität des primären oder sekundären Antikörpers mit dem Blockierungsmittel	Tween-20 zum Inkubations- und Waschpuffer geben
   6	Inkompatibles Blockierungsmittel	Vergleichen Sie verschiedene Blockierungspuffer
   7	Unvollständige Blockierung	Optimieren Sie die Auswahl des Blockierungspuffers Erhöhen Sie die Proteinkonzentration im Blockierungsmittel Blockierzeit und / oder Temperatur optimieren; 2 Stunden bei normaler Temperatur oder über Nacht bei 4 ° C blockieren Fügen Sie 0,05% Tween 20-Waschmittel zum Blockierungsmittel hinzu 0,05% Tween 20-Detergens in die Antikörperverdünnungslösung geben
   8	Unzureichende Blockierung	Verlängern Sie die Blockierungszeit oder verwenden Sie ein kompatibles Blockierungsmittel (z. B. Magermilch, BSA, Serum usw.).
   9	Kreuzreaktivität des Antikörpers mit anderen Proteinen	Verwenden Sie ein anderes Blockierungsmittel (Verwenden Sie keine Magermilch mit Biotinsystem Reduzieren Sie die sekundäre Antikörperkonzentration Testen Sie die Kreuzreaktivität zwischen sekundärem Antikörper und Membran
   10	Unzureichende Wäsche	Erhöhen Sie die Anzahl der Waschvorgänge und das Puffervolumen 0,05% Tween 20-Waschmittel in den Waschpuffer geben
   11	Zu lange Belichtungszeit	Belichtungszeit reduzieren
   12	Membranproblem	Verwenden Sie eine saubere Pinzette. Mit Handschuhen bedienen Verwenden Sie neue Membranen Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit ausreicht, um die Membran feucht zu halten Verwenden Sie bei der Inkubation die Entfärbungstabelle Überlappende Membranen vermeiden Vorsichtig behandeln und Membranschäden vermeiden
   13	Unzureichende Membranwäsche	Erhöhen Sie die Anzahl der Waschvorgänge
   14	Inkompatible Membran	Der Hintergrund der Nitrocellulosemembran ist niedriger als der der PVDF-Membran
   fünfzehn	Trockene Membran	Stellen Sie sicher, dass die Membran mit einer ausreichenden Menge Flüssigkeit bedeckt ist, und verhindern Sie, dass sie austrocknet
   16	Kontaminierter Puffer	Verwenden Sie vor der Verwendung einen neuen Puffer oder Filterpuffer
   17	Kontaminierte Ausrüstung	Stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Werkzeuge sauber sind und kein Gel auf der Membran verbleibt

2. Schwaches / kein Signal

3. 

   western blot

   S.No.	Mögliche Ursache	Lösung
   1	Unsachgemäßer Proteintransfer zur Membran	Färben Sie das Gel nach Abschluss der Übertragung, um festzustellen, ob die Übertragung effizient ist Verwenden Sie Ponceau S, um die Membran zu färben und festzustellen, ob die Übertragung effizient ist Stellen Sie während des Transfers einen ausreichenden Kontakt zwischen Gel und Membran sicher Stellen Sie sicher, dass das Transfer-Sandwich richtig montiert ist Nasse Membran gemäß Anleitung Überhitzung während der Elektroübertragung vermeiden Verwenden Sie Positivkontroll- oder Molekulargewichtsmarker Übertragungszeit und Strom optimieren Verwenden Sie den membranübertragenden Puffer von Boster (AR1149). Vermeiden Sie bei der Handhabung die Zerstörung der Probe (Antigendeterminante)
   2	Unzureichende Protein- und Membranbindung	Zugabe von 20% Methanol zum Transferpuffer Verwenden Sie eine Membran mit kleiner Bohrung
   3	Unzureichender Antikörper	Erhöhen Sie die Antikörperkonzentration
   4	Unzureichendes Antigen	Laden Sie mehr Protein
   5	Antigenmaskierung durch Blockieren des Puffers	Vergleichen Sie verschiedene Blockierungspuffer Optimieren Sie die Proteinkonzentration des Blockierungsmittels Blockierzeit reduzieren
   6	Vorhandensein von Natriumazid in Puffern	Natriumazid aus den Puffern entfernen
   7	Zu kurze Belichtungszeit	Verlängern Sie die Belichtungszeit des Films
   8	Zu kurze Inkubationszeit des Substrats	Die Inkubationszeit des Substrats auf fünf Minuten verlängern
   9	Verdauung von Protein auf der Membran	Menge des Blockierungsmittels optimieren
   10	Proteinabbau während der Lagerung	Proteinprobe erneut vorbereiten
   11	Inkompatible primäre und sekundäre Antikörper	Stellen Sie sicher, dass Primärantikörper, Sekundärantikörper, Substrat, Enzymsystem und Proben kompatibel sind Verwenden Sie die Ladekontrolle, um die Wirksamkeit des zweiten Erkennungssystems zu testen
   12	Niedrige Konzentration an Primärantikörper und / oder Sekundärantikörper	Erhöhen Sie die Antikörperkonzentration Inkubationszeit erhöhen
   13	Kreuzreaktivität zwischen Blockierungsmittel und Antikörpern (primär oder sekundär)	Verwenden Sie ein mildes Reinigungsmittel wie Tween20 Change Blocker (häufig verwendet werden Milch, BSA, Serum oder Gelatine)
   14	Unfähigkeit des primären Antikörpers, das Protein in der getesteten Probe zu erkennen	Überprüfen Sie die Anweisungen Positivkontrolle verwenden
   fünfzehn	Niedriger oder kein Gehalt an Zielprotein (unwirksames Antigen)	Positivkontrolle verwenden Erhöhen Sie die Beladungsmenge auf 20-30 µg Protein pro Vertiefung Verwenden Sie einen Proteaseinhibitor oder ein Zielprotein mit fraktioniertem Extrakt
   16	Unzureichende Übertragung und übermäßiges Waschen	Überprüfen Sie die Übertragung mit Ponceau S. PVDF-Membran in Methanol einweichen Vermeiden Sie übermäßiges Waschen
   17	Überblockierung	Verwenden Sie 0,05% Magermilch oder keinen Milchverdünnungspuffer Blockierungsmittel wechseln Blockierzeit reduzieren
   18	Verlust der Wirksamkeit des Primärantikörpers	Bereiten Sie frischen Antikörper vor und lagern Sie ihn ordnungsgemäß, wenn Sie ihn nicht verwenden Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen
   19	Hemmung des sekundären Antikörpers durch Natriumazid	Vermeiden Sie die Verwendung von Natriumazid zusammen mit HRP-konjugierten Antikörpern
   20	Verlust der Wirksamkeit in Enzymkonjugat und Substrat	Enzymkonjugat und Substrat mischen (keine Farbentwicklung, wenn das Enzym inaktiv ist) Verwenden Sie aktiviertes Enzymkonjugat und frisches Substrat
   21	Unsachgemäße Nassübertragung für die Membran	PVDF-Membran in 100% Methanol einweichen
   22	Unzureichendes Molekulargewicht des Zielproteins (<10 kDa)	Verwenden Sie eine Membran mit kleiner Bohrung Übertragungszeit reduzieren
   23	Gleichheit oder Nähe der Werte zwischen dem isoelektrischen Punkt des Zielproteins und dem pH-Wert des Transferpuffers	Probieren Sie andere Puffer wie CAPS-Puffer (pH 10,5) aus. Versuchen Sie Puffer mit niedrigem pH-Wert wie Essigsäurepuffer
   24	Zu hohe Methanolkonzentration	Verringern Sie die Methanolkonzentration oder verwenden Sie Isopropylalkohol